如何倾听神经元的“对话”

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撰文 | ChenLee

编辑 | shin

Nernst方程：计算某一种离子的平衡电位

GHK方程：根据Nernst方程衍生而来，描述几种离子通透时的膜电位（ps：理想状态，不考虑所谓的饱和现象等）

神经元间的交流：突触及生物电信号

（1）神经元的“感觉器官”：突触

你知道大脑里的神经元是怎么交流的吗？你了解膜片钳或电生理吗？不是实验汪，光看字面可能的第一反应是：what？什么鬼？是用电做生理实验？No. No. No…...推荐没一点感觉的盆友们，可以先看之前的专栏文章《发现动作电位的发生机制》。

早在19世纪末，西班牙解剖学家Cajal通过组化染色确认神经元是构成神经系统的基本单元，并意外发现了位于神经元外部的微小游离末端，提出信息传递效率与方式的位于突触这一概念[1] 。随后，加拿大科学家Donald Hebb发现相连接神经在同步放电后突触连接增强，这一现象进一步佐证了Cajal的观点[2]。1973 年，挪威科学家 Tim Bliss首次发现100Hz高频刺激能引起神经元间突触传递效率的增强，即长时程突触增强（Long-Term Potentiation，LTP）[3]。之后，LTP现象一直被认为是学习记忆形成的分子基础，突触传递效能会伴随神经活动变化而变化这一现象也被称为突触可塑性。

当然，突触也根据传递根据信息递质和传递方式不同分：化学突触和电突触。大致可以参见《植入式脑机接口的神经信号源简介》 中 “什么是 神经元产生的电信号？” 部分的介绍。图1就是展示了神经元之间化学突触的信息传递过程（电信号→化学信号→电信号）：神经元之间的信息传递主要发生在突触部位，在突触末梢以化学递质形式传递至下一级结构。

图1. 化学突触信息传递过程

突触本是一个特化的神经元功能结构，如图2所示，我们可以把它类比作人的眼睛、耳朵和手等感觉器官，负责神经元和神经元之间的信息传递。只不过人没有三头六臂，一个神经元上却可能有上千个突触，是真正的“眼观六路耳听八方”。

图2. 神经元间的信号传递 图片引自：https://helpified.com/uploads/how-do-neurons-talk-to-each-other

神经信息在大脑中如同流水一样，每个神经元存在上下游关系，但是并不是所有的信息都能被有效的逐级传递。大脑中的信息传递主要依靠化学突触，而化学突触中根据主要存储和释放的递质种类，突触本身又可以分为兴奋性和抑制性两类。如图3，GABA为代表的抑制性递质，结合突触后膜的GABAR，引起Cl-内流，使突触后膜神经元超极化。Glu为代表的兴奋性递质，结合突触后膜的AMPAR和NMDAR，引起Na+/Ca2+内流，使突触后膜神经元去极化。

综上，如果把在信息在大脑中的传递比作流水，那么每一级神经元本身就是一个小型水库。要不要将信息（水流）继续向下传递（向下游放水/泄洪），取决于单个神经元接受的所有突触（抑制性和兴奋性）在时间空间上效应的综合，是否达到阈值（水库中蓄水有无超过“警戒”水位）。

2）细胞膜 ≈ 电学元件

通过以上介绍，我们可能对细胞之间的信息传递方式有了简单的概念，知道细胞和细胞之间交流主要在突触，依靠电学化学方式传递。但是为什么细胞自带‘’电属性‘’呢？

图3. 细胞膜及其膜上离子通道蛋白

我们都知道，细胞膜本身由磷脂双分子层组成，细胞膜是电介质，两端类似两极，整体就像一个小型的电容器，可以存储电荷。膜上又有很多的通道蛋白和转运体等，比如Na+、K+、Ca2+通道等，如图3所示，根据通道蛋白的特性不同，我们常将离子通道分类为：电压门控、配体门控、机械门控等。伴随离子通道的开闭会有阴阳离子进出，会有很多的电荷进进出出，因而就有了对电容器元件（细胞膜）的充放电。胞膜两端因为离子种类和浓度的不同，根据Nernst方程计算，可知不同离子进出时产生的电势差。

而我们所知道的动作电位的产生，和静息电位这些的维持，都离不开一系列通道蛋白的共同作用。如对RC电路原理想具体了解，可以参见《诺奖膜片钳专题| 从RC电路到H-H模型》

生物电信号的采集：膜片钳

之前，我们介绍了细胞之间的信息交流的方式。我们大脑里有百亿级神经元数量，单一神经元都及其微小（胞体本身都是μm级别），那么我们在实验操作中是怎么观察和记录到这些神经元信息传递和电化学现象的呢？

对于生物电信号的采集，我们主要运用的是膜片钳系统，其主要组成部分如图4所示。

图4.1膜片钳系统的一般组成（图像版）

图4.2 膜片钳系统的一般组成（文字版）

膜片钳，正如字面所示，核心是“膜”和“钳”。即是用微电极扯下一细胞膜上的小片或者破一个小口，钳制在一定的电位水平，观察细胞膜的电流变化（ps：当然也可以是电流钳模式）。主要存在两种模式：1）电压钳，钳制住电压记录电流变化；2）电流钳，牵制住电流记录电压变化。如图5，我们利用微电极（灌注了电极内液），在微操操作下，可以在μm级别的胞体附近进行操作和记录。

图5. 膜片钳记录操作过程的显微成像

如图6所示，根据记录的不同，膜片钳记录主要又可以分为：（A）细胞贴附式记录、（B）全细胞记录、（C）外面向外记录、（D）内面向外记录。

图6. 膜片钳记录模式 - - 图片引自：http://www.bem.fi/book/04/04.htm

（1）全细胞膜片钳的原理介绍

楼主主要做全细胞和场电位，所以以下可能以全细胞为主简单介绍原理：

因为膜两侧的离子通道开发和关闭，会带来Na+、K+、Ca2+和Cl-等阴阳离子进入，即胞膜两侧均会有电流变化。根据GHK电压方程，我们可计算几种离子通透时膜上的电势差。而这种电位变化，我们便可以通过膜片钳技术，观察一些电学参数，反应细胞膜上的一些动态变化啦。

全细胞记录时，我们往往是通过给细胞注入合适大小的电流，保持电流或者电压不变，去观察相对应参数的变化。如图7所示，全细胞膜片钳等效电路图的放大器部分主要包括：Rf，反馈电阻；A1，运算放大器；A2，单增益放大器。Vc为命令电位，Vp为电极电位，Vo为A2端输出电位。

图7 全细胞膜片钳电压钳模式电路图

其中，运放A1/A2有两端“输入端”和“输出端”。“+”代表同相输入端，即输入越大输出越大；“-”代表反相，输入越大输出越小。之所以能钳制在某一电位水平，主要是依靠内部的负反馈机制，即反馈电阻Rf和运算放大器A1的“虚短路”效应实现。Vc即命令电位，Vp也可看做实际膜电位，如果Vc和Vp之间出现明显差值，这时候Rf就会发挥作用，注入反相电流进行调节（如：Vm↑ → Vp↑ → V1↓ → Vp↑）。综上，膜片钳的“钳”，就是指钳制在某一定值保持不变，而之所以能让电位or 电流钳制在某一定值，主要依赖于放大器中A1部分的虚短路效应和反馈电阻Rf的调节。

（2）膜片钳的应用介绍

其中，全细胞做的最多可能是突触后膜电流（PSC）的测量，主要方法如下：一般钳制在静息电位（做配体型的话），观察生理水平下，一段时间内细胞的（兴奋性/抑制性）突触后膜电流。根据记录的目的，我们可能选择不同的电极内液：比如海马区CA1的IPSC主要是由GABA介导的Cl-电流，那么我们可以选择CsCl/KCl等。然后针对不同内液，我们选择钳制的电位水平也会有所不同，主要考量：先确定要记录哪种离子电流（EPSC？or ISPC？），然后根据Nernst方程去计算介导该电流的某一离子的平衡电位，根据抑制性（外向电流）或兴奋性（内向电流），决定钳制的电位水平。全细胞模式下记录一段时间的PSC，然后分析其幅度（amp）和频率（freq），通过幅度和频率去了解神经元突触区可能的结构变化。

除此之外，全细胞记录模式还可以用于研究配体门控离子通道，突触传递与可塑性等相关研究方面。比如：通过膜电容去观察膜表面积研究胞吞胞吐，通过I-V curve和τ等检测离子通道特性，通过分析PSC和PPR研究神经元间突触传递功能，以及测试AHP/AP Threshold/I-O curve来分析神经元兴奋性等等。当然，膜片钳的应用还是相当广泛的，正如之前说的存在多种记录模式，每种记录模式对应的优缺点和应用各有不同。每个实验室的研究方向不同，所以应用也会有很大差异。

总结

综上，膜上离子的进出引起的电流或电压的改变，因为阴阳离子进出细胞膜，就会产生电流或改变膜电位。膜片钳主要就是就是将变化的电流流经记录电极，然后通过内部反馈电阻的放大器等效计算，最后被我们以对应电压或电流显示观察到哦。

PS：膜片钳其实是一个需要技术和理论紧密结合的手艺活，最好由“师傅”带着开始入门，入行有风险，上手需手稳。顺便说下，我觉得每一位膜片钳记录者，上辈子一定都是“折翼的电工”......

END

附录

参考文献：

1.Ramón y Cajal, S.Estructura de los centros nerviosos de las aves [J]. Rev. Trim. Histol. Norm.Pat. 1, 1-10 (1888).

2.Hebb, D.O. The Organization of Behavior. New York: Wiley & Sons. 1949.

3.Bliss TVP，Lomo T.Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path[J]．J Physiol，1973，(232) : 331－356

参考书籍：

《Principles of Neural Science, Fifth Edit》

《Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission》

《细胞电生理学基本原理与膜片钳技术》.

《实验膜片钳技术》.

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